Home / مطالب / کاربردی / .::(PCR چیست ؟)::.

.::(PCR چیست ؟)::.

PCR) Polymerase Chain Reaction) واکنش زنجیره ای پلیمراز

PCR به علت دارا بودن ویژگی و حساسیت بالا و سرعت و سهولت آن،  جایگاه ویژه ای درتحقیقات و تشخیص های مولکولی پیدا کرده است. PCR   درسال۱۹۸۳ توسط دکتر Mullis ابداع شد،  که جایزه نوبل شیمی را در سال ۱۹۹۳ دریافت کرد.

 

 PCR در محیط آزمایشگاه (in vitro) امکان تکثیر یک توالی معین از DNA راکه بین دو توالی مشخص قراردارد امکان پذیرمی کند تا DNA از نظرمقدار به حد کافی برسد و بتوان روی آن آزمایش هایی مثل الکتروفورز-ژل آگارز- پلی اکریل آمید، هیبریداسیون با پروب را انجام داد.این روش از نظر علمی تشابه زیادی به همانندسازی DNA دارد. دکترMullis  اولین بار ازآنزیمDNA پلیمراز اشریشیا کولی برای انجام PCR استفاده کرد.

 

کاربردPCR

 

تعین جنسیت جنین،  تعیین ژنوتیپ اپی توپهای پیوندی،  تعیین ژنوتیپ گروههای خونیABO،  تهیه نسخه های متعدد از یک ژن، تشخیص بیماریها واختلالات ژنتیکی،  تشخیص بیماریهای عفونی،  ردابوت و تعیین والدین مطالعات باستان شناسی،  تعیین انواع لوسمیها،  تولید و طراحی واکسن های انسانی و دامی،  پزشکی قانونی وانگشت نگاری،  DNA ازروی لکه خشک شده خون،  درتشخیص HIV،  سل وبیماریهای مقاربتی.

درحقیقت این تکنیک می رود تا در آینده نتیجه گیری دادگاهها راتحت تأثیر قرار دهد.

دانشمندان اکنون می توانند میکروارگانیسمهای غیرقابل کشتی را که تاکنون نمی توانستند با روشهای کلاسیک میکروب شناسی مورد مطالعه قرار دهند به کمک PCR مطالعه نمایند .

 

نمونه های مورد استفاده برای آزمایشگاه مولکولیPCR

 

طیف وسیعی از مواد بیولوژیک،  لکه های خون،  سرم،  بزاق،  منی،  مو،  مایع نخاعی،  استخوان،  مایع آمنیون،  سلولهای خودجنین درمرحله بلاستولا،  نمونه های بیوپسی و یا آتوپسی باشند هرچه آلودگی کمترباشد حساسیت ودقت نتایج بیشتر خواهد بود.

 

اصول وروشهای PCR

روش PCR برمبنای سه روش ساده بنا شده که انجام این سه مرحله در هر واکنش سنتز DNA ضرورت داردکه با برنامه دادن به Thermocycler اجرا می شود وعبارتند از:

 مرحله۱  Denaturation: دراین مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای می شود، حرارت۹۰-۹۵ درجه سانتیگراد

مرحله۲ Annealing : دراین مرحله با کاهش حرارت سیستم،  پرایمرها درمحل مناسب روی رشته مکمل متصل می شوند،  دما۵۳-۷۵ درجه سانتیگراد،  درمرحله Anneling باید دقت لازم بعمل آید و دما باید به درستی انتخاب شود این کار توسط کامپیوتر به طور مستقیم ویا توسط محقق و با توجه به دانش فنی وتجربه صورت می گیرد اگر دمای Annealing بدرستی انتخاب نشود احتمال تکثیر غیراختصاصی DNAوجوددارد به طوری که در دمای پایین تر از حداستاندارد Amplication غیراختصاصی و در دمای بالاتر از معمول عدم تکثیرDNA رخ می دهد.

مرحله۳ Extension : در این مرحله که دمای آن برای انزیم DNA پلیمراز مطلوب می باشد موجب توسعه پرایمرها شده و همانندسازی DNA هدف انجام می گیرد. دما حدود۷۲ درجه سانتیگراد آنزیم مقاوم به حرارت Taq polymerase چهارتا نوکلئوتید dATP،   dGTP،   dTTP،   dCTP موجود درمحیط و بافرهای PCR شامل Tris وپرایمرهای جفت شده به DNA را درحضورMgcl2  مورد استفاده قرار می دهد و واکنش پلیمریزاسیون را کاتالیز می نماید وسبب طویل شدن رشته DNA جدیدی که توسط پرایمر ساخته شده است می شود .

 

نتیجه چرخه سه مرحله ای فوق سنتز دو مولکول جدید DNA است، سنتز DNA جدید به صورت تصاعدی آنقدر ادامه می یابد تا اینکه یکی از مواد تشکیل دهنده محیط واکنش کاهش یابد و غیرفعال شود. به طورکلی حدود۳۵-۲۵ سیکل کافی است تا ازمقدار بسیارکم DNA صدها هزارنسخه DNA سنتز گردد. از نظر تئوری بعد از۲۰ سیکل ۱میلیون و بعداز ۳۰سیکل ۱میلیارد کپی حاصل می گردد.نکته ای که درمراحل مختلف PCR بایدمورد توجه قرارگیرد زمان لازم برای رسیدن از یک دما به یک دمای دیگر که زمان کوتاهی است (Ramping Time).

 

پارامترهای مؤثر در PCR:

۱٫      زمان ودمای Denaturation بستگی به تعداد C و G دارد

۲٫      دمای Annealing پرایمرها که باید۴-۳درجه کمترازدمای ذوب پرایمرها باشد

۳٫     زمان Primer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

۴٫      تعداد سیکلها

۵٫     Ramp (زمانی که طول می کشد تا دمای مبدادستگاه به دمای مقصد برسد)هرچه این زمان کمترباشد نتیجه کاربهتراست و واکنش زمان کمتری دردمای ناخواسته قرار می گیرد

۶٫      غلظت dNTP ها ویون منیزیوم(اینها مجموعه ای راتشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز می شوند وغلظت این دوماده تابعی ازیکدیگر می باشند)

۷٫     غلظت Template DNA (یک دهم تایک میکروگرم می باشد)چنانچه DNA هدف به صورت مالتی کپی درژنوم باشد بهتراست

۸٫     اضافه کردن تشدیدکننده های PCR

۹٫      حذف مهارکننده های آنزیم ازمحیط

۱۰٫    بهتراست نقطه ذوب پرایمرها شبیه هم باشدTm).یکسان داشته باشند)

 

طراحی پرایمر:

پرایمرهای PCR به صورت کاملاً اختصاصی و مکمل ناحیه مورد نظرDNA هدف طراحی میگردند. پرایمرها ۳۰-۲۰باز دارند و پرایمرهای بیش از۳۰باز اختصاصیت خوبی ندارند. همچنین پرایمرها باید دمای انیلینگ بالا داشته باشند.بهتراست تعدادبازهای دو پرایمر مساوی باشند واز پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند،  همچنین نواحی تکرار شونده نداشته باشند چنانچه بازهای GیاC به صورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر به صورت لوپ در می آید و عملاً سیستم کار نمی‌کند. نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام می دهند.بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast انها را چک نمود تامشخص شود که با چه ژنهای دیگر می توانند Anneal گردند.

 

استخراجDNA ازخون:

 

۱٫      مقدار۱۰۰ میکرولیتر خون (خون لخته نشده باشد – برای کارهای PCR ازEDTA بعنوان ضدانعقاد استفاده شود زیرا مواد ضدانعقاد دیگر مهارکننده آنزیم پلیمراز میباشند)

۲٫      مقدار ۷۰۰ میکرولیترDNG(ماده ای برای استخراج DNA که به مدت ۲۰ دقیقه در دمای ۳۷درجه که این ماده معرف اصلی کیت می باشد اضافه می کنیم)

۳٫     به مدت ۱۵ثانیه آن را ورتکس می کنیم

۴٫      به مدت ۵دقیقه در دور ۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم

۵٫     سپس خون را از میکروتیوب به میکروتیوب دیگر انتقال می دهیم بدون اینکه لخته ها وارد شود

۶٫      به داخل خون ۵۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم سپس تکان می دهیم تا هاله سفیدرنگی تشکیل شود

۷٫     درفریز ۲۰- درجه به مدت ۲۰ دقیقه قرار می دهیم

۸٫     بعد از فریز به مدت۱۰ دقیقه در دور۱۳۰۰۰ سانتریفیوژ می کنیم

۹٫      محلول رویی را دور ریخته وبه لکه پایین cc1 اتانل ۷۵درصد اضافه می کنیم

۱۰٫    مقدار۵-۲ میکرولیتر آن را برای واکنش PCR استفاده می کنیم

 

استخراج DNA ازبافت:

۱٫      مقدار۱۰۰ میلی گرم بافت توسط ازت مایع پودر می کنیم (به بافت ازت مایع اضافه می کنیم و بوسیله هاون به هم می زنیم) واز این ۱۰۰ میکرولیتر بر می داریم وداخل میکروتیوب می ریزیم

۲٫      ۴۰۰ میکرولیتر DNG به بافت اضافه می کنیم

۳٫     به مدت ۱۵ ثانیه ورتکس می کنیم

۴٫      ۳۰۰ میکرولیتر ایزوپروپانل اضافه می کنیم

۵٫     یک لایه شیری رنگ تشکیل می شود که DNA است به مدت ۲۰ دقیقه داخل فریزر ۲۰- قرار می دهیم

 

بایدها و نبایدها در: PCR

۶٫      آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد.

۷٫     سمپلرهای مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند،  ظروف لوله ها وسرسمپلرها اتوکلاو شوند و هنگام کار از دستکش استفاده شود( برای ممانعت ازعمل آنزیم DNase که سبب تخریب DNA هنگام استخراج DNA می شود وممانعت از عمل آنزیم RNase که سبب تخریب RNAهنگام استخراج RNA می شود) چون این دو آنزیم در محیط کار ودستها زیاد است

۸٫     هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کارتهیه کنید.

۹٫      اعمال قبل وبعد PCR جدا از همدیگر انجام گیرد.

۱۰٫    برای استفاده از هرماده از پیپت جداگانه واختصاصی استفاده کنید.

۱۱٫    هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تاموادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند جدا شده و رسوب کنند.

۱۲٫   چندین کنترل منفی حین آزمایش Runکنید.

۱۳٫   برای انجام آزمایشهای تاییدی از مواد فریز شده استفاده کنید.

۱۴٫   همیشه DNA آمپلی فای شده راخارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید.

۱۵٫   هنگام کار باPCR product مقداری از آن را جداگانه نگهدارید.

 

موادی که برای PCR لازم است :

 

۱٫      بافرPCR – x10 (PCRدرحجم ۲۵یا۵۰ میکرولیترانجام می گیرد برای حجم ۲۵ میکرولیتر ۲٫۵میکرولیتربافرنیاز است.

۲٫      DNTP(نوکلئوتیدها)۰٫۵میکرولیتر

۳٫     ۱ میکرولیتر Mgcl2

۴٫      پرایمر رفت ۱ میکرولیتر

۵٫     پرایمر برگشت ۱ میکرولیتر

۶٫      DNA 1 میکرولیتر

۷٫     آنزیم ۰٫۲ میکرولیتر

۸٫    آب مقطر ۱۷٫۸ میکرولیتر(مجموع مواد بالا منهای ۲۵ می شود ۱۷٫۸ که آب است)

 

بعد از ریختن مواد بالا در لوله های مخصوص PCR لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار دهید ودستگاه را روشن کنید )مقدار ۱۰۰ میکرولیتر روغن معدنی روی واکنش بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد.لازم به ذکر است که دستگاههای ترموسایکلرجدید به صورت Heated lid ساخته شده اند یعنی درب دستگاه که روی لوله های واکنش قرار میگیرد حدود ۱۰۵ درجه گرم میشود در نتیجه بالای لوله گرمتر از پایین آن است واز بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری می شود)  پس از اتمام کار محصول آمپلی فای شده را با اگارز ۳درصد الکتروفورز کنید.

 

انیمیشن جهت آشنایی با PCR

تعریف pcr چیست؟

جهت شروع بروی

continue

در دو تصویر زیر کلیک کنید!

۶ comments

  1. باشکر از مطالب مفیدتان

  2. عالی بود…ممنون از مطالب مفیدتون

  3. سلام مطالب خیلی مفیدی بود من چطوری میتونم این انیمشن رو دانلود کنم ؟ میشه کمکم کنید

  4. کمال نجاتیان

    سلام مقالتون بسیار عالی بود.
    ممنون

  5. عالی بود واقعا کمکم کرد

پاسخ دهید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *